為貫徹《中華人民共和國(guó)環(huán)境保護(hù)法》和《中華人民共和國(guó)水污染防治法》，保護(hù)生態(tài)環(huán)境，保障人體健康，規(guī)范水中總大腸菌群、糞大腸菌群和大腸埃希氏菌的測(cè)定方法，我國(guó)生態(tài)環(huán)境部制定了本標(biāo)準(zhǔn)。下面優(yōu)爾普儀器就和大家分享一下該標(biāo)準(zhǔn)的發(fā)布稿全文。

水質(zhì) 總大腸菌群、糞大腸菌群和大腸埃希氏菌的測(cè)定 酶底物法

Water quality—Determination of total coliforms, fecal coliforms and Escherichia coli—Enzyme substrate method

1 適用范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了測(cè)定水中總大腸菌群、糞大腸菌群和大腸埃希氏菌的酶底物法。

本標(biāo)準(zhǔn)適用于地表水、地下水、生活污水和工業(yè)廢水中總大腸菌群、糞大腸菌群和大腸埃希氏菌的測(cè)定。

本方法的檢出限為10MPN/L。

2 規(guī)范性引用文件

本標(biāo)準(zhǔn)引用了下列文件或其中的條款。凡是不注日期的引用文件，其有效版本適用于本標(biāo)準(zhǔn)。

GB/T 6682 分析實(shí)驗(yàn)用水規(guī)格和實(shí)驗(yàn)方法

GB/T 14581 水質(zhì) 湖泊和水庫(kù)采樣技術(shù)指導(dǎo)

HJ 494 水質(zhì) 采樣技術(shù)指導(dǎo)

HJ/T 91 地表水和污水監(jiān)測(cè)技術(shù)規(guī)范

3 術(shù)語(yǔ)和定義

下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本標(biāo)準(zhǔn)。

3.1 總大腸菌群 total coliforms

37℃培養(yǎng) 24 h，能產(chǎn)生β-半乳糖苷酶(β-D-galactosidase)，分解選擇性培養(yǎng)基中的鄰硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷(ONPG)生成黃色的鄰硝基苯酚的腸桿菌科細(xì)菌。

3.2 糞大腸菌群 fecal coliforms

又稱耐熱大腸菌群(thermotolerant coliforms)。44.5℃培養(yǎng) 24 h，能產(chǎn)生β-半乳糖苷酶(β-D-galactosidase)，分解選擇性培養(yǎng)基中的鄰硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷(ONPG)生成黃色的鄰硝基苯酚的腸桿菌科細(xì)菌。

3.3 大腸埃希氏菌 Escherichia coli

俗稱大腸桿菌。37℃培養(yǎng) 24 h，能產(chǎn)生β-半乳糖苷酶(β-D-galactosidase)，分解選擇性培養(yǎng)基中的鄰硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷(ONPG)生成黃色的鄰硝基苯酚，同時(shí)產(chǎn)生β-葡萄糖醛酸酶(β-Glucuronidase)，分解選擇性培養(yǎng)基中的 4-甲基傘形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷2(MUG)釋放出熒光物質(zhì)(4-甲基傘形酮)的腸桿菌科細(xì)菌。

3.4 最大可能數(shù) most probable number(MPN)

又稱稀釋培養(yǎng)計(jì)數(shù)，是一種基于泊松分布的間接計(jì)數(shù)法。利用統(tǒng)計(jì)學(xué)原理，根據(jù)一定體積不同稀釋度樣品經(jīng)培養(yǎng)后產(chǎn)生的目標(biāo)微生物陽(yáng)性數(shù)，查表估算一定體積樣品中目標(biāo)微生物存在的數(shù)量(單位體積存在目標(biāo)微生物的最大可能數(shù))。

4 方法原理

在特定溫度下培養(yǎng)特定的時(shí)間，總大腸菌群、糞大腸菌群、大腸埃希氏菌能產(chǎn)生β-半乳糖苷酶，將選擇性培養(yǎng)基中的無(wú)色底物鄰硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷(ONPG)分解為黃色的鄰硝基苯酚(ONP);大腸埃希氏菌同時(shí)又能產(chǎn)生β-葡萄糖醛酸酶，將選擇性培養(yǎng)基中的 4- 甲基傘形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷(MUG)分解為 4-甲基傘形酮，在紫外燈照射下產(chǎn)生熒光。統(tǒng)計(jì)陽(yáng)性反應(yīng)出現(xiàn)數(shù)量，查 MPN 表，分別計(jì)算樣品中總大腸菌群、糞大腸菌群、大腸埃希氏菌的濃度值。

5 干擾和消除

5.1 活性氯具有氧化性，能破壞微生物細(xì)胞內(nèi)的酶活性，導(dǎo)致細(xì)胞死亡，可在樣品采集(8.1)時(shí)加入硫代硫酸鈉溶液(6.4)消除干擾。

5.2 重金屬離子具有細(xì)胞毒性，能破壞微生物細(xì)胞內(nèi)的酶活性，導(dǎo)致細(xì)胞死亡，可在樣品采集(8.1)時(shí)加入乙二胺四乙酸二鈉溶液(6.5)消除干擾。

6 試劑和材料

除非另有說(shuō)明，分析時(shí)均使用符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的分析純?cè)噭?，?shí)驗(yàn)用水應(yīng)滿足 GB/T 6682中三級(jí)水的要求。

6.1 培養(yǎng)基。

本標(biāo)準(zhǔn)采用 Minimal Medium ONPG-MUG 培養(yǎng)基。每100 ml樣品需使用培養(yǎng)基粉末2.7 g±0.5 g，所含基本成分如下：

培養(yǎng)基成分

也可采用市售商品化培養(yǎng)基制品。

6.2 硫代硫酸鈉(Na2S2O3·5H2O)。

6.3 乙二胺四乙酸二鈉(C10H14N2O8Na2·2H2O)。

6.4 硫代硫酸鈉溶液：ρ(Na2S2O3)=0.10 g/ml。

稱取 15.7 g 硫代硫酸鈉(6.2)，溶于適量水中，定容至 100 ml，臨用現(xiàn)配。

6.5 乙二胺四乙酸二鈉溶液：ρ(C10H14N2O8Na2·2H2O)=0.15 g/ml。

稱取 15 g 乙二胺四乙酸二鈉(6.3)，溶于適量水中，定容至 100 ml，此溶液保質(zhì)期為30d。

6.6 97 孔定量盤：含 49 個(gè)大孔，48 個(gè)小孔。其中，每個(gè)小孔可容納 0.186 ml 樣品，大孔中 48 個(gè)大孔每個(gè)可容納 1.86 ml 樣品，一個(gè)頂部大孔可容納 11 ml 樣品。也可采用經(jīng)環(huán)氧乙烷滅菌的市售商品化成品。

6.7 標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性比色盤。

6.8 無(wú)菌水：取適量實(shí)驗(yàn)用水，經(jīng) 121℃高壓蒸汽滅菌 20 min，備用。

7 儀器和設(shè)備

7.1 采樣瓶：具螺旋帽或磨口塞的 100 ml、250 ml、500 ml 廣口玻璃瓶。

注：在采集不存在或不考慮余氧、金屬離子干擾的樣品時(shí)，可采用市售無(wú)菌采樣瓶或無(wú)菌采樣袋。

7.2 高壓蒸汽滅菌器：121℃可調(diào)。

7.3 恒溫培養(yǎng)箱：允許溫度偏差 37℃±1℃、44.5℃±0.5℃。

7.4 程控定量封口機(jī)：用于 97 孔定量盤(6.6)的封口。

立科程控定量封口機(jī)

7.5 紫外燈：365～366 nm。

7.6 移液管：1 ml±0.01 ml、10 ml±0.1 ml。也可采用計(jì)量合格的可調(diào)式移液器。

7.7 三角瓶：100 ml。

7.8 量筒：100 ml±1 ml。

7.9 一般實(shí)驗(yàn)室常用儀器和設(shè)備。

注：三角瓶、移液管、采樣瓶等玻璃器皿及采樣器具要在試驗(yàn)前按無(wú)菌操作要求包扎，121℃高壓蒸汽滅菌 20 min，烘干，備用。

8 樣品

8.1 樣品采集

點(diǎn)位布設(shè)及采樣頻次按照 GB/T 14581、HJ/T 494 和 HJ/T 91 的相關(guān)規(guī)定執(zhí)行。

采集微生物樣品時(shí)，采樣瓶(7.1)不得用樣品洗滌，采集樣品于滅菌的采樣瓶中。

采集河流、湖庫(kù)等地表水樣品時(shí)，可握住瓶子下部直接將帶塞采樣瓶插入水中，約距水面 10～15 cm 處，瓶口朝水流方向，拔瓶塞，使樣品灌入瓶?jī)?nèi)然后蓋上瓶塞，將采樣瓶從水中取出。如果沒(méi)有水流，可握住瓶子水平往前推。采樣量一般為采樣瓶容量的 80%左右。樣品采集完畢后，迅速扎上無(wú)菌包裝紙。

從龍頭裝置采集樣品時(shí)，不要選用漏水龍頭，采水前將龍頭打開(kāi)至最大，放水 3～5 min，然后將龍頭關(guān)閉，用火焰灼燒約 3 min 滅菌或用 70%～75%的酒精對(duì)龍頭進(jìn)行消毒，開(kāi)足龍頭，再放水 1 min，以充分除去水管中的滯留雜質(zhì)。采樣時(shí)控制水流速度，小心接入瓶?jī)?nèi)。

采集地表水、廢水樣品及一定深度的樣品時(shí)，也可使用滅菌過(guò)的專用采樣裝置采樣。

在同一采樣點(diǎn)進(jìn)行分層采樣時(shí)，應(yīng)自上而下進(jìn)行，以免不同層次的攪擾。

如果采集的是含有活性氯的樣品，需在采樣瓶滅菌前加入硫代硫酸鈉溶液(6.4)，以除去活性氯對(duì)細(xì)菌的抑制作用(每 125 ml 容積加入 0.1 ml 的硫代硫酸鈉溶液);如果采集的是重金屬離子含量較高的樣品，則在采樣瓶滅菌前加入乙二胺四乙酸二鈉溶液(6.5)，以消除干擾(每 125 ml 容積加入 0.3 ml 的乙二胺四乙酸二鈉溶液)。

注：15.7 mg 硫代硫酸鈉(6.2)可去除樣品中 1.5 mg 活性氯，硫代硫酸鈉用量可根據(jù)樣品實(shí)際活性氯量調(diào)整。

8.2 樣品保存

采樣后應(yīng)在 2 h 內(nèi)檢測(cè)，否則，應(yīng) 10℃以下冷藏但不得超過(guò) 6 h。實(shí)驗(yàn)室接樣后，不能立即開(kāi)展檢測(cè)的，將樣品于 4℃以下冷藏并在 2 h 內(nèi)檢測(cè)。

9 分析步驟

9.1 樣品稀釋

根據(jù)樣品污染程度確定接種量(見(jiàn)表 1)，避免接種樣品培養(yǎng)后 97 孔定量盤(6.6)出現(xiàn)全部陽(yáng)性或全部陰性。接種量小于 100 ml 時(shí)，應(yīng)稀釋樣品后接種，接種量為 10 ml 時(shí)，取 10 ml 樣品加入到盛有 90 ml 無(wú)菌水(6.8)的三角瓶(7.7)中混勻制成 1:10 的稀釋樣品，其他接種量的稀釋樣品依次類推。對(duì)于未知樣品，可選用多個(gè)接種量進(jìn)行檢測(cè)。

9.2 接種

量取 100 ml 樣品或稀釋樣品于滅菌后的三角瓶，加入 2.7 g±0.5 g 培養(yǎng)基(6.1)粉末，充分混勻，完全溶解后，全部倒入 97 孔定量盤(6.6)內(nèi)，以手撫平 97 孔定量盤背面，趕除孔內(nèi)氣泡，然后用程控定量封口機(jī)(7.4)封口。觀察 97 孔定量盤顏色，若出現(xiàn)類似或深于標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性比色盤(6.7)的顏色，則需排查樣品、培養(yǎng)基、無(wú)菌水等一系列因素后，終止試驗(yàn)或重新操作。

注：9.1、9.2 步驟在野外操作時(shí)應(yīng)避開(kāi)明顯局部污染源，建議使用一次性手套、口罩、酒精燈等。

9.3 培養(yǎng)

測(cè)定總大腸菌群和大腸埃希氏菌時(shí)，將封口后的 97 孔定量盤放入恒溫培養(yǎng)箱(7.3)中37℃±1℃下培養(yǎng) 24 h。

測(cè)定糞大腸菌群時(shí)，將封口后的 97 孔定量盤放入的恒溫培養(yǎng)箱中 44.5℃±0.5℃下培養(yǎng)24 h。

9.4 對(duì)照試驗(yàn)

9.4.1 空白對(duì)照

每次試驗(yàn)都要用無(wú)菌水(6.8)按照步驟 9.1～9.3 進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室空白測(cè)定。培養(yǎng)后的97孔定量盤不得有任何顏色反應(yīng)，否則，該次樣品測(cè)定結(jié)果無(wú)效，應(yīng)查明原因后重新測(cè)定。

9.4.2 陰性和陽(yáng)性對(duì)照

總大腸菌群、大腸埃希氏菌、糞大腸菌群的陰性、陽(yáng)性菌株參考表 2。

將標(biāo)準(zhǔn)菌株制成300～3000個(gè)/ml 的菌懸液，將菌懸液按接種(9.2)和培養(yǎng)(9.3)要求操作，陽(yáng)性菌株應(yīng)呈現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng);陰性菌株呈現(xiàn)陰性反應(yīng)，否則，該次樣品測(cè)定結(jié)果無(wú)效，應(yīng)重新測(cè)定。

注：可先制備較高濃度菌懸液，采用血球計(jì)數(shù)器在顯微鏡下對(duì)其濃度進(jìn)行初步測(cè)定，然后根據(jù)實(shí)際情況用無(wú)菌水(6.8)稀釋至 300～3000 個(gè)/ml。

9.4.3 結(jié)果判讀與計(jì)數(shù)

將培養(yǎng)24h后的97孔定量盤進(jìn)行結(jié)果判讀，樣品變黃色判斷為總大腸菌群或糞大腸菌群陽(yáng)性;樣品變黃色且在紫外燈(7.5)照射下有藍(lán)色熒光，判斷為大腸埃希氏菌陽(yáng)性。如果結(jié)果可疑，可延長(zhǎng)培養(yǎng)至28h進(jìn)行結(jié)果判讀，超過(guò) 28 h 后出現(xiàn)的顏色反應(yīng)不作為陽(yáng)性結(jié)果?？墒褂帽Ｙ|(zhì)期內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性比色盤以輔助判讀，參見(jiàn)附錄 A。

分別記錄97孔定量盤中大孔和小孔的陽(yáng)性孔數(shù)量。

10 結(jié)果計(jì)算與表示

10.1 結(jié)果計(jì)算

從97孔定量盤法MPN表中查得每100ml樣品中總大腸菌群、糞大腸菌群數(shù)或大腸埃希氏菌的MPN值(置信區(qū)間參見(jiàn)附錄C)后，再根據(jù)樣品不同的稀釋度，按照公式(1)換算樣品中總大腸菌群、糞大腸菌群數(shù)或大腸埃希氏菌濃度(MPN/L)：

大腸菌群濃度計(jì)算公式

10.2 結(jié)果表示

測(cè)定結(jié)果保留兩位有效數(shù)字，當(dāng)測(cè)定結(jié)果≥100 MPN/L 時(shí)，以科學(xué)計(jì)數(shù)法表示;若 97孔均為陰性，可報(bào)告為總大腸菌群、糞大腸菌群數(shù)或大腸埃希氏菌未檢出或<10 MPN/L。

11 精密度和準(zhǔn)確度

11.1 精密度

6 個(gè)實(shí)驗(yàn)室分別對(duì)低濃度(地下水，濃度均值為 6.0×100MPN/L)、中濃度(地表水，濃度均值為 4.0×10000 MPN/L)和高濃度(生活污水，濃度均值為 9.0×10000000MPN/L)三個(gè)不同濃度細(xì)菌總數(shù)的樣品及有證標(biāo)準(zhǔn)樣品(濃度為 2000 MPN/L)進(jìn)行了 6 次重復(fù)測(cè)定：實(shí)驗(yàn)室內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差范圍分別為 0.26%～1.3%、0.65%～2.0%、1.3%～3.7%和 0.68%～2.8%;實(shí)驗(yàn)室間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為 9.9%、1.3%、4.2%和 1.3%;重復(fù)性限為 0.17、0.18、0.21 和 0.18;再現(xiàn)性限為 1.8、0.23、0.38 和 0.20;實(shí)驗(yàn)室間置信區(qū)間見(jiàn)表 3。

6個(gè)實(shí)驗(yàn)室分別對(duì)低濃度(地下水，濃度均值為70MPN/L)、中濃度(地表水，濃度均值為 9.0×1000MPN/L)和高濃度(生活污水，濃度均值為 2.0×1000000MPN/L)三個(gè)不同濃度細(xì)菌總數(shù)的樣品及有證標(biāo)準(zhǔn)樣品(濃度為 2000MPN/L)進(jìn)行了 6 次重復(fù)測(cè)定：實(shí)驗(yàn)室內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差范圍分別為 0.69%～1.9%、0.93%～2.9%、5.4%～21%和 1.8%～3.0%;實(shí)驗(yàn)室間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為 9.6%、1.6%、15%和 3.7%;重復(fù)性限為 0.23、0.21、0.58 和 0.19;再現(xiàn)性限為 1.7、0.26、0.90 和 0.35;實(shí)驗(yàn)室間置信區(qū)間見(jiàn)表 4。

6個(gè)實(shí)驗(yàn)室分別對(duì)低濃度(地下水，濃度均值為 1.0×100MPN/L)、中濃度(地表水，濃度均值為 1.3×10000MPN/L)和高濃度(生活污水，濃度均值為 3.0×1000000MPN/L)三個(gè)不同濃度細(xì)菌總數(shù)的樣品及有證標(biāo)準(zhǔn)樣品(濃度為3700MPN/L)進(jìn)行了 6 次重復(fù)測(cè)定：實(shí)驗(yàn)室內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差范圍分別為 0.40%～2.4%、1.3%～2.9%、3.4%～17%和 2.4%～9.2%;實(shí)驗(yàn)室間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為 8.9%、6.4%、6.6%、6.4%;重復(fù)性限為 0.22、0.26、0.58 和 0.55;再現(xiàn)性限為 1.6、0.76、0.64 和 0.75;實(shí)驗(yàn)室間置信區(qū)間見(jiàn)表 5。

11.2 準(zhǔn)確度

6家實(shí)驗(yàn)室對(duì)總大腸菌群有證標(biāo)準(zhǔn)樣品(2000 MPN/L)進(jìn)行了 6 次重復(fù)測(cè)定：實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的相對(duì)誤差范圍為-6.4%～-3.5%;相對(duì)誤差的最終值為-4.7%±1.2%。

6家實(shí)驗(yàn)室對(duì)大腸埃希氏菌群標(biāo)準(zhǔn)樣品(2000 MPN/L)進(jìn)行了 6 次重復(fù)測(cè)定：實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的相對(duì)誤差范圍為-15%～-6.3%;相對(duì)誤差的最終值為-13%±3.3%。

6家實(shí)驗(yàn)室對(duì)糞大腸菌群的有證標(biāo)準(zhǔn)樣品(3700 MPN/L)進(jìn)行了 6 次重復(fù)測(cè)定：實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的相對(duì)誤差范圍為-17%～-0.81%;相對(duì)誤差的最終值為-13%±6.1%。

注：微生物檢測(cè)數(shù)據(jù)為偏態(tài)分布，其測(cè)定結(jié)果全部經(jīng)以 10 為底對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后進(jìn)行計(jì)算。

12 質(zhì)量保證和質(zhì)量控制

12.1 每批樣品按對(duì)照試驗(yàn)(9.4)進(jìn)行空白對(duì)照測(cè)定，定期使用有證標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行陽(yáng)性和陰性對(duì)照試驗(yàn)。

12.2 每 20 個(gè)樣品或每批次樣品(≤20 個(gè)/批)測(cè)定一個(gè)平行雙樣。

12.3 對(duì)每批次培養(yǎng)基須使用有證標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行培養(yǎng)基質(zhì)量檢驗(yàn)。

12.4 定期使用有證標(biāo)準(zhǔn)菌株/標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行質(zhì)量控制。

13 廢物處理

實(shí)驗(yàn)中產(chǎn)生的廢物經(jīng) 121℃高壓蒸汽滅菌 20 min 后，作為一般廢物處理。

　　以上就是HJ1001-2018水質(zhì) 總大腸菌群、糞大腸菌群和大腸埃希氏菌的測(cè)定 酶底物法發(fā)布稿標(biāo)準(zhǔn)的全部?jī)?nèi)容了，有需要的朋友可以參考。